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07.11.2011

Daniel Gebhard - Neues Kapitel in der mitochondrialen Theorie der Alterung

Hautalterung und Hautkrebs werden seit geraumer Zeit mit UV-Strahlen in Verbindung gebracht. Es wird angenommen, dass Mutationen in der mitochondrialen DNA dabei eine große Rolle spielen. Daher spielt das Wissen über die Art und Weise, wie Reparaturmechanismen der Hautzellen funktionieren, für das Verständnis und die Prävention eine große Rolle. Daniel Gebhard, Doktorand an der Hochschule Albstadt-Sigmaringen, erforscht im Rahmen seiner Doktorarbeit die Reparaturkapazität der mitochondrialen DNA in verschiedenen menschlichen Hautzelltypen. Dabei liegt sein Hauptaugenmerk unter anderem auf der Entwicklung einer Echtzeit-Messung von Reparaturenzymen.

Portrait von Daniel Gebhard, Doktorand an der Hochschule Albstadt-Sigmaringen
Daniel Gebhard, Doktorand an der Hochschule Albstadt-Sigmaringen (© private)

Alter ist ein wichtiger Faktor für die Anfälligkeit gegenüber Mutationen, sowohl im Zellkern als auch den Mitochondrien. Zum einen besteht eine enge Korrelation der DNA-Reparaturfähigkeit von Organismen mit ihrer Lebenserwartung, zum anderen sinkt die Aktivität verschiedener Reparaturenzyme altersabhängig. „Nach der mitochondrialen Theorie der Alterung sorgen Mutationen in der mtDNA (mitochondrialen DNA, Anm. d. Red.) dafür, dass die in der mtDNA kodierten Proteine in ihrer Funktion gestört werden“, berichtet Daniel Gebhard, der an der Hochschule Albstadt-Sigmaringen verschiedene Hautzelltypen hinsichtlich ihrer Reparaturfähigkeit untersucht. Bei mitochondrialen Mutationen tritt ein zusätzlicher Effekt in Erscheinung. „Im Kern werden Mutationen etabliert, wenn bei der Zellteilung die DNA-Polymerase auf einen DNA-Schaden trifft und infolgedessen ein falsches Nukleotid einfügt“, erklärt Gebhard. Diese Mutation wird dann an eine der Tochterzellen weitergegeben. Mitochondriale Mutationen werden auch ohne Zellteilung etabliert, da die mitochondriale DNA unabhängig von dieser repliziert wird.

Sonnenlicht: Ursache für DNA-Schäden und Mutationen

In der Haut kommt es zu intrinsischen Faktoren, die die DNA schädigen. Ein noch stärkerer, äußerer Faktor ist aber das Sonnenlicht. „Fibroblasten, die nicht aus der Haut stammen und ein hohes Level einer bestimmten photoassoziierten Mutation tragen, zeigen ähnliche molekulare Eigenschaften auf wie Fibroblasten aus photo-gealterter Haut“, sagt Daniel Gebhard. Außerdem treten diese Effekte auch auf, wenn die mitochondriale DNA in den Zellen depletiert wird. Die Verbindung von mtDNA-Mutationen mit Krebs im Allgemeinen beruht historisch vor allem auf dem Warburg-Effekt. Otto Warburg hatte entdeckt, dass viele Krebszellen ungewöhnlich hohe Laktatwerte aufweisen. „In der Tat gewinnen viele Krebszellen ihre Energie aus der Glykolyse und nicht mehr aus der oxidativen Phosphorylierung“.

So wird vermutet, dass die gestörte mitochondriale Funktion die Ursache für Krebsentstehung sein könnte. Kausal konnte das aber bis jetzt noch nicht bewiesen werden. „Es scheint so zu sein, dass die Krebszellen absichtlich auf die Glykolyse als Form der Energiegewinnung zurückgreifen, obwohl die mitochondriale Atmungskette noch intakt ist.“ Krebszellen, bei denen man die Glykolyse unterbindet und sie dadurch zur Energiegewinnung durch oxidative Phosphorylierung zwingt, verlangsamen ihr Wachstum. „In der Haut ist bis jetzt kein kausaler Zusammenhang zwischen Krebs und mtDNA-Mutationen belegt“, sagt Daniel Gebhard.

Drei Hautzelltypen - drei Vorteile

Im Rahmen seines Forschungprojekts nimmt Daniel Gebhard drei Hautzelltypen genauestens unter die Lupe: die Fibroblasten, die Keratinozyten und die Melanozyten. Diese unterscheiden sich bei der Isolierung durch die „Ausbeute“ und bei der Kultivierung durch die Kosten sowie ihre mögliche Kulturdauer. „Fibroblasten sind am einfachsten und schnellsten zu isolieren, am längsten in Kultur zu halten und dabei am wenigsten kostentreibend“, fasst Daniel Gebhard zusammen. "Deswegen werden sie am häufigsten eingesetzt.“ Keratinozyten kommen schneller als Fibroblasten auf Zellzahlen, bei denen man sie für Experimente einsetzen kann, können allerdings nur für wenige Passagen in Kultur gehalten werden und müssen deswegen immer neu isoliert werden. „Außerdem ist die Isolierung aus Hautstücken älterer Spender oft schwierig“, wie Gebhard bemerkt. Die Isolierung von Melanozyten dauert am längsten und ist bei älteren Spendern manchmal auch problematisch. Wenn allerdings eine gute Kultur isoliert ist, können sie ebenso lang in Kultur gehalten werden wie Fibroblasten. Auch in Experimenten können Unterschiede auftreten, zum Beispiel bei Transfektionsversuchen.

Mikroskopische Aufnahme der drei Hautzelltypen, Fibroblasten Keratinozyten, Melanozyten
Daniel Gebhard untersucht drei Hautzelltypen (v.l.: Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten)  (© Daniel Gebhard)

Daniel Gebhard wendet verschiedene Teilschritte an, um die Reparaturkapazität der mtDNA analysieren zu können, da sie nur indirekt erfasst werden kann. Eine wichtige Methode ist dabei das Verfahren der Genexpressionsanalyse, bei der RNA aus Zellen isoliert, cDNA davon synthetisiert und eine PCR für die Zielgene sowie Gene, die als Quantifizierungsstandard dienen (Housekeeping-Gene), durchgeführt wird. „Viele Proteine, die in die Mitochondrien transportiert werden, tragen eine mitochondriale Lokalisierungssequenz, die auch in der mRNA kodiert ist, und können so von ihren Counterparts im Kern unterschieden werden“, beschreibt der Doktorand. Das wesentlich schnellere Verfahren des „Host Cell Reactivation Assay" ist bei Mitochondrien leider nicht möglich. Bei dieser Methode wird ein etwa durch UV-Strahlung geschädigtes Plasmid, welches mit einem Reporterprotein kodiert ist, in eine Zelle transfiziert, um dort zu messen, wie schnell wieviel Plasmid-DNA repariert wird. Da Mitochondrien nicht transfizierbar sind, ist dies keine Option.

Aktivität von Reparatur-Enzymen in Echtzeit messen

Daneben arbeitet Daniel Gebhard an einer Methode, mit der die Aktivität von Reparaturenzymen in einer Kinetik in Echtzeit gemessen werden kann. „Dazu wird ein DNA-Stück mit dem Schaden einem Zelllysat inkubiert und die Exzision des Schadens beobachtet“, so Gebhard. Das Reporterkonstrukt fluoresziert dann, sobald der Schaden ausgeschnitten ist. Ein Nachteil der Methode, die für einen richtigen Einsatz noch der Optimierung bedarf, ist jedoch, dass man erst Mitochondrien isolieren muss und gerade bei Hautzellen hierfür eine große Zellmenge benötigt wird, um genug mitochondriales Protein isolieren zu können. Ein weiterer Schwerpunkt des Projekts ist die Untersuchung mitochondrialer Mutationen. Mitochondriale Mutationen sind in Haut(zellen) ein interessanter Marker für UV-Exposition. Eine der Mutationen, die Gebhard analysiert, ist die 4977 bp Common Deletion. „Diese wurde zuerst in hohen Konzentrationen in der mitochondrialen DNA von Patienten mit dem Kearns-Sayre-Syndrom beschrieben“, bemerkt der Forscher. Sie ist in nichtproliferativen Geweben mit hohem Energieumsatz alterungsassoziiert und in Haut der Standard-DNA-Marker für UV-Exposition.

Gebhard hat eine PCR-Methode etabliert, um den Grad von Cytosin-Cytosin nach Thymin-Thymin Transitionen zu bestimmen. Diese Mutationen werden durch Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPDs), einer Läsionsart an der DNA, an der Cytosin-Cytosin-Sequenz verursacht. „Die Unterscheidung zwischen Wildtyp und Mutation erfolgt dabei über die Primer. Der Primer für die Mutation enthält an seinem 3‘-Ende zwei Adenine sowie eine absichtliche Fehlpaarung eine Base davor. Bindet der Primer an Wildtyp-DNA, „passen“ drei Nukleotide am Ende des Primers nicht und er kann nicht verlängert werden, wodurch kein PCR-Signal entsteht“, erklärt Daniel Gebhard. Findet der Primer sein mutiertes Gegenstück, passt nur die drittletzte Base nicht und es kann ein Signal entstehen, fügt der Doktorand hinzu.

Forschung an zwei Fronten

Daniel Gebhard promoviert an der Hochschule Albstadt- Sigmaringen und ist gleichzeitig Stipendiat beim Graduiertenkolleg RTG1331 der Universität Konstanz. Dadurch ist er in ständigem Austausch mit Forscherkollegen beider Einrichtungen. „Über das RTG in Konstanz habe ich die Möglichkeit Kurse und Seminare an der Universität extern zu besuchen und ich kann mich mit den dortigen Doktoranden austauschen, was essenziell für meine Arbeit ist.“ Seine Forschungsarbeit findet hauptsächlich in Sigmaringen statt, was dem Doktoranden sehr entgegen kommt. „Die Ausstattung in Sigmaringen ist für die Größe der Hochschule exzellent, und im Gegensatz zur Universität Konstanz ist die Nachfrage nach Großgeräten in den Labors in Sigmaringen weitaus geringer, so dass man eher zum Zug kommt“, berichtet Gebhard. Durch seine Arbeit an zwei Forschungseinrichtungen profitiert Gebhard aber insbesondere durch eine doppelte Betreuung. In Sigmaringen steht ihm Prof. Jörg Bergemann zur Seite, in Konstanz Prof. Alexander Bürkle.

Ein Beitrag von:
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Philipp Sowa - 07.11.2011
© BIOPRO Baden-Württemberg GmbH

Weitere Informationen zum Beitrag:

Daniel Gebhard
Hochschule Albstadt-Sigmaringen
Tel.: +49 (0) 7571/ 732 - 8375
E-Mail: gebhard(at)hs-albsig.de

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